Thematischer Schwerpunkt

Die Dysregulation von Proteasen ist bei vielen pathophysiologischen Prozessen von zentraler Bedeutung. So sind Proteasen an der Tumorprogression und Metastasierung unmittelbar beteiligt und werden von zahlreichen Malignomen auch in das Blut sezerniert. Werden Blutproben von Tumorpatienten mit geeigneten Reporterpeptiden inkubiert, ist der Nachweis einer spezifischen Proteaseaktivität durch Spaltung solcher Reporterpeptide möglich. Die Detektion proteolytischer Fragmente kann durch massenspektrometrische Analyse erfolgen, welche im niedermolekularen Massebereich ein optimales Auflösungsvermögen hat. Durch Kombination multipler Reporterpeptide kann die diagnostische Sensitivität und Spezifität des funktionellen Proteaseprofilings weiter erhöht werden. Wesentlicher Vorteil des Reporter Peptid Spikings gegenüber konventionellen Massenspektrometrie-basierten Profiling Ansätzen ist die gute Standardisierbarkeit des Verfahrens, da Sondenkonzentration und Inkubationsdauer strikt kontrollierbar sind; daraus ergibt sich die Möglichkeit für den unmittelbaren diagnostischen Einsatz dieser Technologie unter Routinebedingungen.   

Stand der Forschung

Alle Versuche, die Massenspektrometrie für unmittelbare diagnostische Zwecke einzusetzen, sind bisher hauptsächlich an präanalytischen Problemen gescheitert (McLerran et al.). Insbesondere für komplexes klinisches Probenmaterial wie Serum oder Plasma konnte gezeigt werden, dass die massenspektrometrischen Profile sich stark zeitabhängig verändern. Eine strikte und notwendige Standardisierung der Präanalytik ist unter Routinebedingungen aber nicht zu gewährleisten. Darüber hinaus, setzen sich massenspektrometrische Profile von Serumproben enttäuschenderweise aber nicht aus krankheitsassoziierten Biomarker sondern ausschließlich aus proteolytischen Spaltprodukte hoch-abundanter Serumproteine und zusammen (Koomen et al.). Durch Inkubation von Serumproben mit exogenen, synthetischen Reporterpeptiden kann eine spezifische Exo-Proteaseaktivität besser detektiert werden; weiterhin ist eine Standardisierung der Reaktionsbedingungen in Analogie zu andere Enzymaktivitätsmessungen der klinisch-chemischen Analytik gut möglich (Villanueva et al.). Da viele krankheitsassoziierte Proteasen wie Matrixmetalloproteasen und Cathepsine aber zu den  Endo-Proteasen zählen, ist die Technologie des Reporter Peptid Spiking von uns weiterentwickelt worden. 

Eigene Vorarbeiten

Der unmittelbare Einsatz massenspektrometrischer Analysen von Serumproben für diagnostische Zwecke ist aufgrund der hohen präanalytischen Variabilität nicht möglich (Findeisen 2005 et al.). Durch aufwändige Standardisierung lassen sich dennoch diskrete krankheitsassoziierte Veränderungen in massenspektrometrischen Profilen nachweisen, die allerdings nur proteolytische Fragmente von hoch-abundanten Proteinen wie Serum-Amyloid A darstellen (Findeisen 2009 et al.). Durch Spiking von Serumproben mit exogenen Reporterpeptiden lässt sich nicht nur die Standardisierung (Findeisen 2007 et al.) sondern auch die Klassifikationsgenauigkeit verbessern (Findeisen 2008 et al.). Da Serum eine hohe proteolytische Grundaktivität unter anderem durch Proteasen der plasmatischen Gerinnung, des Fibrinolyse- und Komplementsystems aufweist, muss der Reporter Peptid Mix in seiner Zusammensetzung entsprechend optimiert werden. Idealerweise werden für die Spiking Experimente nur solche Peptidsubstrate verwendet, welche mit hoher Spezifität und nahezu ausschließlich von den krankheitsassoziierten Proteasen gespalten werden; durch systematische Screening Untersuchungen konnte bereits eine Reihe von spezifischen d.h. durch krankheitsassoziierte Proteasen prozessierte Reporter Peptiden identifiziert werden (Schaal et al.). Auch eine Identifikation der beteiligten Proteasen ist durch native Fraktionierung mit der Free Flow Elektrophorese gelungen (Neustadt et al.) und erleichtert weiterhin die Optimierung der Reporterpeptide.

Ausblick

Für eine systematische Identifikation von geeigneten Proteasesubstraten sind Screeninguntersuchungen an komplexen Peptidbibliotheken erforderlich (Turk et al., Thomas et al.). Diese Peptidbibliotheken werden in einer Screening-Phase nach geeigneten Reporterpeptiden durchsucht, welche spezifisch nur von tumorassoziierten Proteasen gespalten werden. Nach Auswahl geeigneter Reporterpeptide sollte es möglich sein, einen „diagnostischen“ Peptid-Chip zu konstruieren, der in einer Validierungs-Phase an zahlreichen Serumproben von Patienten mit unterschiedlichen Tumorentitäten getestet wird.

Es ist zu erwarten, dass das multiparametrische „Protease-Profiling“ gegenüber den etablierten Tumormarker-Bestimmungen eine Verbesserung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität ermöglicht.

Literatur

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• Thomas D, Francis P, Smith C, Ratcliffe S, Ede N, Kay C, et al. A broad-spectrum fluorescence-based peptide library for the rapid identification of protease substrates. Proteomics 2006;6:2112-20,  PubMed 16479534,  DOI.

 

 Proteomic Core Facility

Mitglieder der Arbeitsgruppe

PD Dr. med. Peter Findeisen
Dipl. Ing. (FH) Victor Costina
MSc Diego Yepes

Kontakt
Dr. med. Peter Findeisen
Institut für Klinische Chemie, Universitätsmedizin Mannheim
Tel. +49 621 383 3483
Fax +49 621 383 3819
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